Дифференцировка iPSC в глию: астроциты, олигодендроциты, микроглия

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) можно направленно превратить во все основные типы глии: астроциты, олигодендроциты и микроглию. Астроциты и олигодендроциты проходят через стадию нейральных предшественников. Микроглия идёт другим путём, через миелоидные предшественники. От протокола зависят сроки, зрелость клеток и то, увидите ли вы в чашке тот дефект, ради которого строили модель. Ниже разбираем, как устроена дифференцировка глии из iPSC, где чаще всего ошибаются и как такая модель помогает искать лечение ультраредкого генетического заболевания.

Hopeatrarelabs

Модель глии для поиска терапии

RareLabs создаёт модели редких генетических заболеваний из клеток пациентов и проверяет потенциальные варианты лечения.

Посетить RareLabs

TL;DR

Из iPSC получают три основных типа глии. Астроциты и олигодендроциты происходят из нейроэктодермы, а микроглия из миелоидной линии, поэтому протоколы у них принципиально разные.
Главная ловушка в незрелости. Короткие протоколы часто дают клетки с маркерами, но без функций, а длинные растягиваются больше чем на два месяца.
Для редких болезней золотой стандарт выглядит так: линия пациента плюс изогенный контроль, исправленный CRISPR.
Когда болезнь затрагивает взаимодействие клеток, 2D-монокультуры мало что показывают. Нужны кокультуры или органоиды.
Зрелая и проверенная глиальная модель пригодна для скрининга препаратов и проверки ASO и генотерапии до клиники.

Содержание

Почему глия, а не только нейроны

Глия составляет самый многочисленный тип клеток центральной нервной системы. Она поддерживает гомеостаз мозга, образует миелин, защищает и питает нейроны. Долгое время клеточные модели неврологических болезней строили почти только на нейронах. Но при многих заболеваниях первично страдает именно глия: лейкодистрофии затрагивают олигодендроциты и миелин, часть болезней начинается с астроцитов, часть с микроглии.

В ответ на болезнь или травму глиальные клетки меняют свои функции и сами начинают вносить вклад в патологию. Если в модели нет нужного типа глии, такой механизм просто не будет виден.

Вторая причина связана с видовыми различиями. Человеческая глия эволюционно заметно отличается от глии других видов, поэтому результаты, полученные на мышах, не всегда переносятся на человека. Для ультраредкого варианта мышиной модели часто нет вообще, а образец мозговой ткани пациента получить невозможно. iPSC решают обе проблемы: это возобновляемый источник клеток с полным генетическим фоном конкретного человека.

Три ветви глии: что получают и как

По направленной дифференцировке глии из iPSC накоплено много работ. Обзор в Frontiers in Cellular Neuroscience сводит протоколы для астроцитов, олигодендроцитов и микроглии и разбирает их применение для моделирования болезней. Общая логика видна из таблицы.

Тип глии	Происхождение в развитии	Типичные сигналы в протоколах	Ключевые маркеры	Что проверять функционально
Астроциты	Нейроэктодерма, через нейральных предшественников и радиальную глию	Факторы роста и цитокины семейства IL-6 (например, CNTF), сыворотка или её заменители	GFAP, S100B, AQP4, ALDH1L1	Захват глутамата, кальциевые волны, поддержка синапсов
Олигодендроциты	Нейроэктодерма, через предшественников олигодендроцитов (OPC)	Ретиноевая кислота, активация SHH, PDGF-AA, тиреоидный гормон T3	OLIG2, SOX10, O4, MBP	Образование миелина вокруг аксонов
Микроглия	Миелоидная линия, через гемопоэтических предшественников	IL-34, CSF1, TGF-β1	IBA1, P2RY12, TMEM119, CX3CR1	Фагоцитоз, ответ на воспалительные стимулы
Радиальная глия	Ранние нейральные предшественники	Активация NOTCH и JAK/STAT для последующего глиального переключения	PAX6, SOX2, NES, HOPX	Способность давать и нейроны, и глию

Две практические детали из таблицы стоит запомнить. Во-первых, протоколы микроглии не пересекаются с нейральными: попытка получить её «по дороге» в нейральной культуре обычно не работает, её дифференцируют отдельно и затем подсаживают. Во-вторых, для астроцитов и олигодендроцитов важно, какую региональную идентичность получили предшественники. Спинальные, корковые и мозжечковые клетки различаются, и для болезни с конкретной локализацией это имеет значение.

Как идёт дифференцировка по этапам

Детали протоколов различаются, но путь от iPSC к нейроэктодермальной глии обычно выглядит так.

Контроль исходной линии. Перед стартом проверяют плюрипотентность, кариотип и отсутствие микоплазмы, а в линии пациента подтверждают сам вариант. Ошибка на этом шаге обесценивает всё, что будет дальше.
Нейральная индукция. Двойное ингибирование SMAD переводит iPSC в нейроэктодерму. Получаются нейральные предшественники (NPC) или розеточные структуры.
Регионализация. Морфогены (ретиноевая кислота, SHH, WNT, FGF) задают передне-заднюю и дорсо-вентральную идентичность. От этого зависит, какую глию и какого региона вы получите.
Глиальное переключение. Предшественники долго размножают с факторами роста. Со временем они теряют склонность давать нейроны и начинают давать глию, повторяя то, что в развитии мозга происходит позже нейрогенеза.
Спецификация и созревание. Для астроцитов это цитокины и длительная культура. Для олигодендроцитов это PDGF-AA и затем T3 для созревания. Пример пошагового протокола получения астроцитов из NPC опубликован на protocols.io.
Характеризация. Иммуноцитохимия и проточная цитометрия по маркерам, экспрессия генов и, главное, функциональные тесты.

Микроглия проходит свой путь: iPSC сначала направляют в мезодерму и гемопоэтические предшественники, затем в миелоидные клетки и дозревают с IL-34, CSF1 и TGF-β1. Если вам важны контрольные точки на каждом этапе нейральной дифференцировки, подробно их разбираем в статье о контрольных точках при дифференцировке iPSC для редких болезней.

Зрелость: главная ловушка глиальных моделей

В глиальных работах чаще всего ошибаются именно со зрелостью. Авторы одного из протоколов прямо пишут, что получение астроцитов из iPSC долго упиралось либо в дифференцировку длиной больше двух месяцев, либо в короткие протоколы с незрелыми клетками, у которых нет ключевых свойств зрелых астроцитов. Та же работа предлагает ускоренный путь к астроцитам со зрелой звёздчатой морфологией. Это показывает, что вопрос решается подбором условий, а не только временем.

Почему зрелость важна для редкой болезни? Если дефект проявляется в функции, например в захвате глутамата, накоплении субстрата или формировании миелина, то незрелые клетки его просто не покажут. Отсутствие фенотипа в такой модели ничего не говорит о болезни, это свойство протокола. Глия созревает и в организме долго, вплоть до постнатального периода, поэтому исследователи советуют подбирать протокол под ту стадию развития и тот фенотип, которые нужно изучить.

Как мы проверяем зрелость на практике:

Смотрим не на один маркер, а на панель. Одного GFAP мало: его экспрессируют и реактивные предшественники.
Ставим функциональный тест, соответствующий болезни. Для лейкодистрофии смотрим на миелинизацию или накопление субстрата, для астроцитопатии на захват глутамата и кальциевые ответы.
Сравниваем транскриптом с референсными данными по первичной ткани, когда такие данные есть.
Фиксируем день анализа и держим его одинаковым для всех линий. Иначе разница между пациентом и контролем может оказаться разницей в возрасте культуры.

2D, кокультуры и органоиды: когда что выбирать

Монокультура в 2D дешевле, быстрее и лучше масштабируется. Для скрининга тысяч соединений это часто единственный реалистичный формат. Но многие глиальные фенотипы возникают на стыке клеток: миелин нужен аксону, микроглия реагирует на нейроны и астроциты.

Два свежих примера показывают, что дают трёхмерные системы. При наследственной диффузной лейкоэнцефалопатии с аксональными сфероидами (HDLS), редкой и фатальной болезни, которую чаще всего вызывают мутации CSF1R, исследователи построили органоиды мозга с достаточным содержанием микроглии. Без микроглии механизм этой болезни в модели не воспроизвести. При атаксии Фридрейха использовали мозжечковые органоиды, обогащённые бергмановской глией, потому что мозжечок с его клеточным разнообразием очень трудно изучать in vitro.

Практическое правило такое:

2D-монокультура подходит, если дефект клеточно-автономный и проявляется в самой глиальной клетке: накопление субстрата, нарушение белка, стресс.
Кокультура нужна, если вопрос во взаимодействии двух типов клеток: нейрон и олигодендроцит, нейрон и микроглия.
Органоид выбирают, когда важны тканевая архитектура, региональная идентичность или сложные межклеточные сети.

Часто разумно комбинировать. Фенотип находят и подтверждают в более сложной системе, а затем переносят упрощённый, но достоверный показатель в 2D-формат для скрининга.

Изогенный контроль: без него сравнение ненадёжно

Даже у здоровых людей iPSC-линии различаются по скорости и эффективности дифференцировки. Для глии с её долгими протоколами этот разброс особенно заметен. Если сравнивать клетки пациента с клетками неродственного донора, трудно отделить эффект варианта от эффекта генетического фона.

Поэтому стандартом стало использовать линию пациента вместе с изогенным контролем, в котором вариант исправлен. Исправляют обычно с помощью CRISPR. Обе линии идентичны по всему геному, кроме одного варианта, и любое устойчивое различие между ними можно связать именно с ним. Это особенно важно для ультраредких болезней, где у вас может быть один пациент и ни одного второго для сравнения. Подробнее о том, как доказать, что модель отражает болезнь, мы пишем в материале о валидации клеточной модели для редкого заболевания.

Сравнение пациентской и исправленной изогенной линий

Ещё один источник ошибок описан в обзоре о текущих ограничениях моделирования болезней на iPSC: это вариабельность между клонами и между партиями дифференцировки. Ответ простой, хотя и трудоёмкий. Нужно брать несколько клонов, проводить независимые дифференцировки и заранее определять критерии, по которым фенотип считается воспроизведённым.

От глиальной модели к поиску лечения

Зачем всё это семье или врачу? Модель нужна, чтобы проверять лечение. iPSC дают масштабируемое количество клеток, значимых для болезни, и на них можно проводить скрининг препаратов. Для ультраредких болезней особенно интересны уже одобренные лекарства: если что-то сработает, путь к применению короче. О том, как устроен такой поиск, читайте в статье про off-label скрининг препаратов.

Второе направление связано с точными генетическими подходами. В работе по кристаллической дистрофии Биетти показано, что клетки пациента позволяют проверить лечение ещё до включения человека в клиническое исследование: подобрать вектор генотерапии, дозу и отобрать пациентов. Та же логика применима к глии. Если вариант подходит для антисмыслового олигонуклеотида (ASO), его эффект можно проверить в глиальных клетках пациента, сравнив их с изогенным контролем.

Важно и то, как результат описан. Врачу, семье и фонду нужен понятный отчёт: какая модель, какой фенотип, что проверяли, что сработало и с какой уверенностью. Мы разбираем это в материале о пяти обязательных блоках отчёта iPSC-скрининга.

Если вы принимаете решение о лечении, результаты клеточной модели не заменяют консультацию. Обсудите их с лечащим неврологом или генетиком, который знает историю болезни. Лабораторный результат даёт гипотезу и данные, но назначение остаётся за врачом.

От глиальной модели к поиску лечения — overview diagram

Наш взгляд: глия ради вопроса, а не ради глии

Мы работаем с ультраредкими и недиагностированными генетическими болезнями. Главный урок для нас такой: тип клеток выбирают после того, как поставлен вопрос. Сначала мы разбираемся, где и как проявляется вариант, оцениваем его с помощью нашего AI-инструмента RINAE и решаем, подходит ли мишень для того или иного типа терапии. Только после этого выбираем клетки. Если болезнь глиальная, модель на нейронах даст красивые данные, которые ничего не скажут о пациенте.

Второе правило для нас: никакого скрининга без валидированного фенотипа. Мы строим модель из клеток самого пациента, создаём изогенный контроль с помощью CRISPR и только после этого запускаем параллельные проверки: библиотеку примерно из 3 000 одобренных FDA препаратов, индивидуальные ASO и оценку генотерапии. Параллельность здесь ключевая. Семьи с ультраредким диагнозом не могут ждать, пока один подход отработает до конца, прежде чем начнётся следующий.

И третье: прозрачность. Мы прямо говорим, что модель показала, а чего не показала. Отсутствие эффекта тоже результат, если модель была зрелой и воспроизводила болезнь.

— John

Если вам нужна модель для конкретного пациента

Hopeatrarelabs строит персональные модели болезни на основе iPSC пациента и ведёт программу поиска терапии целиком: от исследования применимости и научной дорожной карты до скрининга препаратов, разработки ASO и подготовки данных для IND. Типичный срок программы составляет 12–15 месяцев, а предварительное рассмотрение случая бесплатно. Расскажите нам о своём случае, а о том, как устроена работа с моделью, можно прочитать в нашем гиде по разработке iPSC-модели редкой болезни.

Частые вопросы

Сколько времени занимает получение глии из iPSC?

Зависит от типа клеток и нужной зрелости. Для астроцитов есть ускоренные протоколы примерно на месяц, но классические занимают больше двух-трёх месяцев. Олигодендроциты традиционно получают дольше всего, если не использовать принудительную экспрессию транскрипционных факторов. Микроглию дифференцируют отдельным миелоидным путём, и обычно это быстрее.

Можно ли получить глию из клеток крови или кожи пациента?

Да. Из клеток крови или фибробластов кожи сначала получают iPSC, а затем направленно дифференцируют их в нужный тип глии. Для пациента это означает обычный забор крови или небольшую биопсию кожи, без доступа к ткани мозга.

Чем глия из iPSC лучше животной модели при редкой болезни?

Она несёт точный вариант и весь генетический фон конкретного человека, а человеческая глия заметно отличается от мышиной. Для ультраредкого варианта животной модели часто просто нет, а её создание занимает годы. При этом iPSC-модель не воспроизводит организм целиком, поэтому её результаты служат основанием для дальнейших шагов, а не окончательным ответом.

Нужны ли органоиды, или хватит обычной культуры?

Если дефект проявляется внутри самой глиальной клетки, обычно достаточно 2D-культуры, и её проще масштабировать для скрининга. Если болезнь связана с взаимодействием клеток, например микроглии с нейронами или миелина с аксонами, нужны кокультуры или органоиды. Часто фенотип подтверждают в сложной системе, а скрининг проводят в упрощённой.