未确诊遗传变异的功能验证：如何把VUS变成可用的证据

做完外显子组或全基因组测序，报告上可能只写着一个“意义未明变异”（VUS），也可能什么都没找到。对未确诊变异做功能验证，就是在实验室里直接测量这个变异有没有改变基因或蛋白的功能：有没有让剪接出错，有没有让蛋白失去活性，有没有在患者相关的细胞里造成能测出来的异常。按照现行的变异分类规则，只有经过验证的功能实验才能提供有分量的证据。这篇文章写给手里拿着不确定结果的患者家庭，也写给需要推进诊断的临床医生和研究者。我们会讲清楚功能验证能做什么、不能做什么、有哪些方法，以及怎样一步步往前推。

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让变异线索连接治疗探索

RareLabs 利用患者来源的疾病模型测试候选治疗方案，为超罕见及未确诊遗传病探索潜在选择。

了解 RareLabs 的研究

简述

VUS 指证据还不够，既不能判为致病，也不能判为良性。按 ACMG/AMP 框架，VUS 不应用于临床决策。
功能验证要回答的是一个具体问题：这个变异在与疾病相关的细胞或分子层面，是否造成了可测量的异常。
常用方法包括 RNA 测序、患者来源的 iPSC 细胞模型、CRISPR 构建的同基因对照、多重变异效应检测，以及酶活性或蛋白稳定性实验。
实验要算作临床证据（PS3 或 BS3），必须先用已知的致病和良性对照完成验证，测的也必须是与疾病相关的功能。
患者自身的细胞模型除了能回答“变异是否致病”，还可以作为平台，继续测试候选治疗方案。

为什么测完序还是没有答案

测序技术让罕见病诊断前进了一大步，但离“人人都能确诊”还很远。法国一项名为 Rares 的临床研究在登记信息中写到，高通量测序能为约一半患者做出诊断，剩下的一半往往卡在这个问题上：找到了候选变异，却无法下结论。

卡住的原因通常有三类。

第一，变异找到了，但证据不够。 很多错义变异和内含子变异，计算机预测工具给出的结论互相矛盾，人群数据库里又查不到，最后只能被归为 VUS。

第二，变异在非编码区，测序报告不擅长解读。 一篇 2025 年发表的研究指出，外显子组和基因组测序在识别和分类非编码变异方面仍有局限，包括内含子变异和隐蔽剪接位点改变。这类变异的效应只有在 RNA 或蛋白层面才看得见。

第三，基因与疾病的关联本身还没确立。 如果一个基因从未被确认与某种疾病有关，那么对它上面的变异直接套用 ACMG 标准是常见的错误。有教学资料特别提醒，这种情况下要先核实基因与表型是否匹配，然后才谈得上验证变异的功能。关于如何把表型和基因型对应起来，可以参考我们的罕见病表型与基因型整合指南。

VUS 是什么，又不是什么

ACMG/AMP/CAP 框架把变异分为五级：致病、可能致病、意义未明、可能良性、良性。其中“可能致病”和“可能良性”对应的把握度都在 90% 以上，而 VUS 不应作为临床决策的依据。

患者家庭最需要知道的一点是：同一份资料指出，VUS 后来被重新分类时，大约九成是往良性方向调整，而不是致病。所以，拿到 VUS 不等于找到了病因。如果有人建议您仅凭一个 VUS 去做预防性手术、停用正在使用的药物，或者做其他无法挽回的医疗决定，请先和您的遗传咨询师或临床遗传科医生面谈，确认这个变异目前的分类和依据。

反过来，VUS 也不代表“没用”。在症状明确、又没有其他解释的家庭里，一个 VUS 往往就是最值得用功能实验去验证的线索。重新分类的具体策略和证据整合流程，我们在 VUS 重分类实务指南中有更详细的说明。

功能证据在分类中的位置：PS3 与 BS3

在 ACMG/AMP 规则中，功能实验对应两条证据：PS3（功能研究显示有损害效应，支持致病）和 BS3（功能研究显示无损害效应，支持良性）。这两条的分量都很重，所以门槛也很高。

ClinGen 序列变异解读工作组在 2019 年发表的建议里明确：实验要作为 PS3 或 BS3 使用，必须用一组已知致病和已知良性的对照变异来验证，否则不同实验室的结果会相互矛盾。没有通过验证的实验，在诊断上几乎没有分量。ClinGen 的通用变异审核流程同样写明，只有经过验证和认可的实验才能纳入分类证据。

已知致病与良性对照验证功能实验

此外，实验测量的必须是与疾病机制相关的功能。比如一个通过功能丧失致病的基因，检测酶活性、蛋白稳定性是合理的；如果测的是与疾病无关的某个指标，即使结果阳性，也说明不了问题。对于非编码区变异，2022 年的专家建议指出，往往需要量身定制的实验，具体取决于变异的位置和预测效应，例如它是否影响剪接。完整的分类思路，可以对照我们的罕见变异致病性分类框架。

常用的功能验证方法

没有一种方法适合所有变异。选择哪种，取决于变异类型、基因在哪些组织中表达，以及需要回答的问题。

方法	适合回答的问题	主要优势	主要限制
RNA 测序（血液、皮肤成纤维细胞等）	变异是否造成异常剪接、表达下降或等位基因失衡	可直接用患者样本，周期相对短	基因若不在可获取的组织中表达，就看不到效应
患者来源的 iPSC 及其分化细胞	变异在神经元、心肌细胞等疾病相关细胞中的表型	保留患者完整的遗传背景，可分化成难以取样的细胞类型	建模和分化需要时间，不同供体之间差异较大
CRISPR 同基因对照	观察到的表型是否确实由这个变异引起	排除遗传背景干扰，因果关系更清楚	需要精细的基因编辑和多克隆验证
多重变异效应检测（MAVE）与 MPRA	同一基因或调控区内大量变异的功能影响	一次检测成千上万个变异	需要针对每个基因建立并验证实验体系
酶活性、蛋白稳定性等靶向实验	特定蛋白功能是否丧失或改变	机制明确，便于解读	只适合功能已知、可测量的蛋白
模式生物（如线虫、斑马鱼）	保守基因的变异在活体中的效应	可观察整体发育和行为	物种差异使结果需要谨慎外推

RNA 测序：常被低估的第一步

对很多未确诊家庭来说，RNA 测序是性价比最高的起点。前面提到的 2025 年研究汇总指出，在常规外显子组或基因组测序之外加做 RNA 测序，可将罕见病诊断率提高 10% 到 35%；纳入临床流程后，从分析到得出结论的中位时间约为 9 周。

但它的效果高度依赖组织。如果致病基因不在血液或皮肤中表达，就需要更复杂的手段，例如把细胞转分化成诱导神经元，才能得到有临床意义的数据。同一研究也强调，生物信息学预测和真实生物学之间常有落差，最终往往要把 RNA 测序和患者特异的细胞模型结合起来，才能看到异常剪接或蛋白活性丧失这类可测量的分子表型。

iPSC 与 CRISPR：把患者的细胞变成实验平台

当疾病主要影响大脑、心脏或肌肉这类无法直接取样的器官时，患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）提供了一条路：用皮肤或血液细胞重编程，再分化成相关细胞类型。哪种细胞才是“对的”细胞，直接决定实验能否看到表型，我们在疾病相关细胞类型的识别方法中专门讨论过。iPSC 建模的原理和完整流程，可以看我们的 iPSC 患者细胞模型实操指南。

iPSC 研究有一个公认的难点：不同人的细胞本来就有差异。神经精神疾病领域的研究者指出，病例对照式的 iPSC 研究常受供体间异质性的限制，因此越来越多团队用 CRISPR 构建同基因对照：在患者细胞中把变异修正回来，或在健康细胞中引入同一变异，两组细胞只差这一个位点。如果表型随变异出现、随修正消失，因果关系就清楚得多。

CRISPR 修复和引入变异的细胞作为对照

高通量多重检测：一次测成千上万个变异

对于 VUS 特别多的基因，逐个验证太慢。多重变异效应检测（MAVE）可以同时评估大量变异。以林奇综合征相关基因 MSH2 为例，一项大规模功能研究的结果与专家临床解读的一致率高达 96%。2025 年发表在《自然》上的一项研究，则对 BRCA2 变异做了系统的功能评估和临床分类。2024 年的一篇综述总结了如何生成、验证高通量功能数据并纳入临床分类。

这类方法的价值在于“提前备好答案”：等到某个患者真的携带其中一个变异时，证据已经在那里了。不过，对于超罕见基因，通常还没有人建立这样的数据集，个案化的实验仍然不可替代。

一个可靠的功能实验，要过哪几关

在委托或评估一项功能验证之前，可以用下面几条来检验方案：

基因与疾病的关联是否成立。 如果关联本身存疑，先补齐表型和文献证据。
测的功能是否与疾病机制相关。 功能丧失、功能获得、显性负效应，各自需要不同的读数。
细胞或组织是否合适。 基因必须在所用的细胞里表达，表型才可能出现。
是否有已知致病和良性对照。 这是 ClinGen 对 PS3/BS3 的核心要求。
是否有同基因对照或多个独立克隆。 用来区分变异效应和背景噪音。
重复性和统计方法是否交代清楚。 结果要能被其他实验室复核。
结果如何回到临床。 数据要能交给检测实验室或遗传咨询师，用于重新分类。

如果变异是新发的，还是从父母遗传来的，也会影响解读和家庭的再发风险评估，这部分可以参考我们关于新发变异与遗传变异的检测要点。

给患者家庭和临床医生的行动路线

整理现有材料。 收齐原始测序报告、变异的具体命名（HGVS）、详细病历和家系信息。
请检测实验室或遗传咨询师复核。 询问这个 VUS 目前的证据缺口在哪里，是缺人群数据、家系分离数据，还是缺功能证据。
先考虑 RNA 层面的证据。 如果变异可能影响剪接，并且基因在血液或皮肤中表达，RNA 测序往往是最快的突破口。
确定是否需要细胞模型。 当基因主要在神经、心肌等组织中表达，或需要观察细胞表型时，可以考虑患者来源的 iPSC 模型加 CRISPR 同基因对照。
评估实验方案的证据等级。 用上一节的七条标准逐项核对。
把结果交回临床。 功能数据应提交给出具报告的实验室，由他们按 ACMG/AMP 规则重新评估分类。
同步关注治疗方向。 一旦确认了致病机制，就可以开始查找相关临床试验，或在同一细胞模型上测试候选疗法。寻找试验的方法可以看我们的罕见病临床试验寻找指南。

我们的看法

我们每天接触的，都是在漫长诊断之路后仍然没有答案的家庭。我们的体会是：功能验证不应只停留在“这个变异算不算致病”这一个问题上。对于没有任何获批疗法的超罕见病，确认致病只是第一步，家庭真正想知道的是“接下来能做什么”。

所以我们从患者自己的细胞出发，用 iPSC 建立疾病模型，用 CRISPR 构建同基因对照，先建立一个能稳定测量的疾病表型。这个表型一旦成立，它既是变异致病性的功能证据，也是后续筛选药物、设计反义寡核苷酸（ASO）的读数。同一套模型，回答两个问题。

我们也坚持一件事：数据要透明。实验做了什么、对照是什么、哪些结果是阴性的，都应该原样交给家庭和他们的医生。阴性结果同样有价值，它可以帮助一个变异被重新归为良性，也能让家庭少走弯路。科学上不确定的地方，我们会直说。

— John

从功能验证走向治疗探索

如果您的家庭或您的患者已经有了候选变异，但缺少功能证据，也没有可用的疗法，RareLabs 的患者个性化建模与筛选服务可以作为下一步。我们的服务包括：基于患者细胞的 iPSC 疾病模型构建与生物样本库存储；疾病表型检测实验；用于评估靶点和突变可干预性的 RINAE 人工智能评分；可干预性研究与发现路线图；约 3,000 种 FDA 已批准药物的高通量筛选；定制 ASO 的设计、合成和体外挽救验证；以及支持新药临床试验申请（IND）的数据包和法规准备。一个完整项目通常在 12 到 15 个月内完成。我们与患者、家庭、医生科学家、基金会和生物医药企业合作，每个项目都按个案制定方案。

常见问题

功能验证能保证确诊吗？

不能。功能实验提供的是证据，最终分类还要结合人群数据、家系信息和临床表型综合判断。有些变异做完实验后被归为良性，这同样是有价值的结论，它意味着需要继续寻找其他病因。

拿到 VUS 结果，需要马上做功能验证吗？

不一定。先请遗传咨询师评估这个变异与您的症状是否吻合、证据缺口在哪里。如果表型高度符合、又没有其他解释，功能验证就很值得考虑；如果只是偶然发现、与症状无关，通常定期复查分类即可。

用血液样本就够了吗，还是一定要做干细胞模型？

取决于基因在哪里表达。如果基因在血液或皮肤细胞中表达，RNA 测序和成纤维细胞实验可能就足够；如果它主要在神经或心肌中起作用，就需要通过 iPSC 分化或转分化得到相关细胞，才能看到表型。

功能验证的结果怎样才能写进临床报告？

实验需要用已知致病和良性对照完成验证，测量与疾病机制相关的功能，并把完整数据交给出具报告的检测实验室。实验室会按 ACMG/AMP 及 ClinGen 的规则决定是否采用 PS3 或 BS3 证据，并据此更新分类。

确认致病之后，还能做什么？

可以用同一个患者细胞模型测试候选疗法，例如已获批药物的老药新用、针对特定变异设计的 ASO，或评估基因治疗的可行性。同时也可以查找相关临床试验和患者组织。任何治疗决定都应与您的主治医生和临床遗传科医生共同做出。