Репрограммирование фибробластов в iPSC: метод, сроки, контроль

Репрограммирование фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) превращает обычные клетки кожи пациента в клетки, которые могут стать почти любой тканью организма: нейронами, кардиомиоцитами, клетками печени. На практике путь такой: небольшая биопсия кожи, несколько недель выращивания фибробластов, доставка факторов репрограммирования, около месяца ожидания колоний и ещё несколько недель на отбор и проверку клонов. Ниже мы разбираем каждый этап, сравниваем методы доставки, показываем, где чаще всего теряется время, и объясняем, что нужно, чтобы линия действительно годилась для поиска терапии редкого заболевания.

Hopeatrarelabs

От клеток пациента к поиску терапии

Hopeatrarelabs создаёт персональные модели редких заболеваний из клеток пациентов и проверяет потенциальные варианты лечения.

Узнать о подходе

Кратко

Фибробласты кожи остаются самым изученным исходным материалом для iPSC: их легко получить панч-биопсией, а протоколы культивирования отработаны десятилетиями.
От доставки факторов до колоний, которые можно переносить, обычно проходит 22–30 дней, а эффективность большинства стандартных методов ниже 1 %.
Для моделей заболеваний предпочтительны неинтегрирующие методы (РНК, вирус Сендай, эпизомы), чтобы в геноме не оставалось чужой ДНК.
Колонии ещё не линия: нужна проверка плюрипотентности, кариотипа, стерильности, микоплазмы и генетической идентичности.
Самая сильная модель редкой болезни сравнивает клетки пациента с изогенным контролем, в котором мутация исправлена с помощью CRISPR.

Содержание

Почему исходным материалом чаще всего служат фибробласты

Теоретически iPSC можно получить из многих типов соматических клеток: из клеток крови, эпителия мочи, кератиноцитов, клеток дермального сосочка волоса. Но фибробласты кожи до сих пор считаются основной точкой отсчёта. Авторы протокола РНК-репрограммирования, опубликованного в 2018 году, прямо называют фибробласты наиболее широко используемым источником соматических клеток: их просто получить, а культуральные методики для них самые зрелые.

Для семьи пациента это понятная и щадящая процедура. Дерматолог или генетик под местной анестезией берёт панч-биопсию диаметром несколько миллиметров, обычно с внутренней стороны предплечья. Образец в транспортной среде отправляют в лабораторию, где из него выращивают первичную культуру фибробластов. Этот этап занимает несколько недель и зависит от возраста пациента, состояния кожи и бережности транспортировки.

Есть и альтернативы. Обзор комитета JSRM-ISCT по клеточным терапиям на основе iPSC называет типичными стартовыми клетками фибробласты и клетки крови, включая CD34+ гемопоэтические клетки и эритробласты. Кровь удобнее брать, особенно у маленьких детей. Но для моделирования редких болезней фибробласты ценны и сами по себе: уже на этой стадии на них иногда видна часть клеточного фенотипа, а запас замороженных клеток страхует на случай, если репрограммирование придётся повторить.

Выбор исходной ткани влияет на результат. В российском исследовании, опубликованном в Acta Naturae, клетки дермального сосочка волоса репрограммировались с эффективностью около 0,03 %, а дермальные фибробласты в тех же условиях давали около 0,01 %. Цифры невелики в обоих случаях, поэтому качество стартовой культуры решает многое.

Что происходит с клеткой при репрограммировании

Суть метода в том, чтобы временно включить в зрелой клетке набор транскрипционных факторов, которые поддерживают плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток. Классический набор, описанный в обзоре методов получения iPSC человека, включает OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC. Под их действием фибробласт постепенно «стирает» программу специализированной клетки: меняется морфология, перестраивается хроматин, включаются собственные гены плюрипотентности.

Процесс неэффективен по своей природе. Большинство клеток либо не начинают перестройку, либо застревают на промежуточных стадиях, либо погибают. Лишь небольшая доля проходит путь до конца и образует плотные колонии с чёткими краями, похожие на колонии эмбриональных стволовых клеток. Отсюда главная практическая задача: получить достаточно таких колоний, чтобы было из чего выбирать.

После репрограммирования клетка сохраняет геном пациента, включая патогенный вариант. Именно поэтому iPSC так ценны для редких болезней: из них можно вырастить тот тип клеток, который поражён у конкретного человека, и изучать болезнь на его собственном генетическом фоне.

Путь от биопсии до проверенной линии

Последовательность этапов в большинстве лабораторий похожа, хотя детали протоколов различаются.

Биопсия и первичная культура. Из кусочка кожи выращивают фибробласты, затем замораживают несколько аликвот на ранних пассажах.
Проверка исходного материала. Стерильность, микоплазма, иногда кариотип. Ошибка на этом шаге стоит месяцев работы на следующих.
Доставка факторов. Факторы вводят в клетки одним из методов: вирус Сендай, синтетическая мРНК, эпизомальные плазмиды и другие (сравнение ниже).
Появление колоний. По данным протокола 2018 года, после репрограммирования вирусом Сендай колонии обычно готовы к отбору примерно на 29-й день, а при трансфекции мРНК липосомальным реагентом уже к 24-му. В целом этап занимает 22–30 дней.
Отбор и размножение клонов. Отдельные колонии переносят вручную, затем линию стабилизируют в течение нескольких пассажей.
Очистка от вектора. Для Сендая и эпизом проверяют, что следы вектора исчезли из клеток.
Характеризация и банкирование. Подтверждают плюрипотентность, кариотип и идентичность донору, создают мастер-банк замороженных клеток.

Один нюанс, о котором редко пишут в кратких протоколах: номер пассажа фибробластов. Клетки, которые слишком долго росли в культуре, теряют способность к делению, и выход iPSC из них заметно падает. Поэтому фибробласты разумно репрограммировать на ранних пассажах и хранить запас «молодых» клеток.

Методы доставки факторов: сравнение

В ранних работах использовали ретро- и лентивирусы, которые встраивают трансгены в геном. Для фундаментальных исследований это допустимо, но для моделей болезней и тем более для клинических задач остаточные встройки нежелательны: они могут влиять на поведение клеток и искажать фенотип. Авторы сравнительного обзора в Stem Cell Reviews and Reports подчёркивают, что iPSC обычно получают из дермальных фибробластов и всё чаще неинтегрирующими методами, чтобы исключить остатки трансгенов.

Метод	Встраивание в геном	Сильные стороны	Ограничения
Вирус Сендай (РНК-вирус)	Нет	Стабильный результат, работает и на фибробластах, и на клетках крови	Нужно ждать, пока вирус исчезнет; последовательности векторов в коммерческих наборах закрыты
Синтетическая мРНК	Нет	Никакой ДНК, полный контроль над составом коктейля	Требует ежедневных трансфекций и тонкой оптимизации
Эпизомальные плазмиды	Как правило, нет	Доступность, простая электропорация	Нужна ПЦР-проверка исчезновения плазмид; на фибробластах эффективность скромная
Ретро- и лентивирусы	Да	Исторически надёжная эффективность	Остаточные трансгены, неприемлемы для клинических задач
Химические коктейли	Нет	Без генетических конструкций	Для клеток человека пока отработаны хуже

О вирусе Сендай стоит сказать подробнее. Исследователи, описавшие его применение, отмечают стабильные результаты и высокую эффективность при умеренной стоимости. Однако коммерческие системы на его основе запатентованы, а точные последовательности векторов не раскрываются. Если линия плохо репрограммируется из-за самой болезни, это ограничивает возможность изменить состав коктейля. Методы на основе мРНК сложнее в настройке, зато полностью прозрачны. Пошаговое описание работы с Сендаем для фибробластов и мононуклеаров крови есть в открытом протоколе на protocols.io.

Контроль качества: чем линия отличается от набора колоний

Получить колонии ещё не значит получить модель. В обзоре о культивировании iPSC подчёркивается, что геномная нестабильность и эпигенетическая вариабельность остаются известными проблемами, поэтому каждую линию нужно проверять на плюрипотентность, стабильность и клональную идентичность. Иначе «фенотип болезни» может оказаться артефактом культуры.

Хороший ориентир даёт Национальный институт неврологических расстройств и инсульта США (NINDS). Все линии в его репозитории сопровождаются сертификатом, где указаны стерильность, восстановление после разморозки, кариотип, совпадение с донором, маркеры стволовых клеток и плюрипотентность. Если лаборатория передаёт вам линию без подобного набора данных, стоит задать вопросы.

Минимальный набор проверок обычно включает:

морфологию колоний и экспрессию маркеров плюрипотентности (например, OCT4, NANOG, SSEA4, TRA-1-60);
способность дифференцироваться в производные трёх зародышевых листков;
кариотип или анализ числа копий, чтобы исключить приобретённые хромосомные аномалии;
подтверждение идентичности донору и сохранения патогенного варианта;
тесты на микоплазму и стерильность;
для Сендая и эпизом: отсутствие остаточного вектора.

Как доказать, что модель действительно отражает болезнь, мы подробно разобрали в материале о валидации клеточной модели редкого заболевания.

Изогенный контроль: зачем исправлять мутацию с помощью CRISPR

Две линии iPSC от разных людей отличаются миллионами генетических вариантов. Если сравнить клетки пациента с клетками здорового родственника, трудно сказать, какое различие вызвано именно патогенной мутацией. Решение: изогенная пара. Из линии пациента с помощью CRISPR создают линию, в которой мутация исправлена, а весь остальной геном идентичен.

Этот подход поддерживает и FDA. В исследовательском проекте агентства на примере мышечной дистрофии Дюшенна учёные строят модель «клинических исследований в чашке» на основе клеток пациентов и геномно-отредактированных iPSC, чтобы оценить, может ли такая модель упростить разработку лекарств для редких болезней. Обзор о моделировании редких заболеваний добавляет, что iPSC позволяют изучать болезнь в контексте генетического фона конкретного человека, а животные модели часто такой возможности не дают.

Согласие пациента: этап, который нельзя пропустить

Семье этот шаг кажется формальностью, но именно от него зависит, можно ли будет использовать линию дальше. NINDS требует, чтобы согласие охватывало широкий обмен линиями и данными с академическими и промышленными партнёрами, включая полногеномное секвенирование. Если согласие было узким, научно безупречную линию может оказаться нельзя передать фармкомпании или в многоцентровое исследование. Обсудите формулировки с генетиком или координатором исследования до биопсии, а не после.

Регуляторные рамки в США

Сама по себе лабораторная работа с iPSC для моделирования болезни и скрининга не является клиническим исследованием. Но как только речь заходит о применении у человека, вступают в силу правила FDA. Агентство указывает, что обладает регуляторными полномочиями в отношении генетически модифицированных клеток и их производных и требует подачи заявки IND (Investigational New Drug) до начала клинического исследования. Для семьи это значит: данные клеточной модели помогают сформулировать гипотезу и обсудить её с лечащим врачом, но не заменяют клиническое решение. Любое изменение лечения по итогам скрининга принимает врач, который ведёт пациента.

Можно ли превратить фибробласты сразу в нейроны

Да, существует прямая конверсия, или трансдифференцировка: фибробласт превращают в нейроноподобную клетку, минуя стадию плюрипотентности. Это быстрее, но такие клетки не размножаются, и для каждого эксперимента нужна новая партия фибробластов. Путь через iPSC длиннее, зато даёт неисчерпаемый источник клеток, банк для повторных экспериментов и возможность получить изогенный контроль. Для скрининга тысяч соединений второй вариант обычно практичнее. О контрольных точках дифференцировки читайте в нашем материале о получении нейронов из iPSC, а о том, как повысить выход нужных клеток, в статье об эффективности дифференцировки.

Сравнение прямой конверсии и пути через iPSC

Наш взгляд: репрограммирование как первый шаг поиска терапии

Мы в RareLabs видим в репрограммировании фибробластов не самоцель, а фундамент всей дальнейшей работы. Для семьи с ультраредким или недиагностированным заболеванием линия iPSC ценна только тогда, когда из неё можно вырастить поражённый тип клеток, увидеть измеримый фенотип и проверить, исправляет ли его какое-либо вмешательство.

Наш взгляд: репрограммирование как первый шаг поиска терапии — overview diagram

Поэтому мы ведём работу параллельно, а не последовательно. Пока создаётся и проверяется линия пациента, мы готовим изогенный контроль с исправленной с помощью CRISPR мутацией, а затем на одной модели тестируем сразу несколько направлений: библиотеку примерно из 3 000 одобренных FDA препаратов, индивидуально спроектированные антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) и варианты генной терапии. Наш собственный ИИ-инструмент RINAE помогает заранее оценить, насколько мутация вообще поддаётся тому или иному подходу.

Мы считаем, что семья и врач должны понимать каждый этап: что сделано, какие проверки пройдены, что показал скрининг и чего он не доказывает. Весь путь от модели до результатов у нас занимает 12–15 месяцев. Мы прямо говорим, что клеточная модель даёт гипотезу, которую дальше обсуждают с лечащими врачами и при необходимости переводят в регуляторный путь.

— John

Если вы ищете лабораторию, которая возьмёт на себя весь путь от биопсии до проверенной модели и скрининга, посмотрите наши программы: создание iPSC-модели пациента с биобанкированием, скрининг около 3 000 одобренных FDA препаратов, разработка ASO и подготовка к IND. Предварительное рассмотрение случая у нас бесплатное, а начать можно с исследования применимости и научной дорожной карты заболевания. Как устроен весь этот путь, мы описали в полном гиде по разработке iPSC-модели редкой болезни.

Частые вопросы

Как получить iPSC из фибробластов?

Сначала из биопсии кожи выращивают фибробласты. Затем в них неинтегрирующим методом вводят факторы плюрипотентности (обычно OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC) и через 3–4 недели отбирают появившиеся колонии. Клоны размножают, очищают от вектора и проверяют на плюрипотентность, кариотип и идентичность донору, и только после этого линию считают готовой к работе.

Сколько времени занимает репрограммирование?

Сами колонии появляются примерно через 22–30 дней после доставки факторов. Но с учётом выращивания фибробластов, отбора клонов, характеризации и банкирования до проверенной линии обычно проходит несколько месяцев. Сроки зависят от метода, качества исходных клеток и того, как болезнь влияет на их рост.

Какой метод репрограммирования лучше для моделирования редкой болезни?

Для моделей заболеваний выбирают неинтегрирующие методы: вирус Сендай, синтетическую мРНК или эпизомальные плазмиды. Сендай удобен и стабилен, мРНК даёт полную прозрачность и гибкость, эпизомы доступны, но на фибробластах менее эффективны. Выбор зависит от исходных клеток и от того, насколько трудно репрограммируется конкретная линия.

Можно ли использовать уже хранящиеся фибробласты пациента?

Часто да, если клетки хранились правильно, не слишком долго росли в культуре и прошли проверку на микоплазму и стерильность. Важно также, чтобы исходное информированное согласие допускало получение iPSC и передачу линии партнёрам. Если согласие было узким, его обычно нужно оформить заново.